利用Ion半導體測序開展基因表達譜分析

             研究顯示雜交芯片可產生大約兩百萬個已定位的讀取[7]，但也有研究證實，即使讀取數目過億，提高讀取數目仍然繼續增加其信息量 那么，究竟Ion PGM™測序儀生成多少個100 base讀取能相當于一個基因表達微陣列芯片呢？在白皮書[9]中我們對Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays （HG-U133 Plus 2.0）的芯片質量控制（MAQC）的微陣列數據與Ion PGM™系統生成的RNA-Seq數據進行了比較。圖1顯示了Ion PGM™測序儀數據按照不同檢測閾值下所得的基因數和微陣列芯片所能檢測到的基因數。當采用zui嚴謹的檢測閾值即每個基因≥10讀取時，兩百萬個來自Ion PGM™測序儀的已定位讀取所能檢測到的基因數超過了微陣列芯片能檢測的基因。

             當讀取計數閾值放寬到≥5讀段數/基因時，僅僅1百萬個Ion RNA-Seq已定位讀取所能檢測到的基因數就超過了芯片的基因檢測數。利用來自Ion PGM™測序儀的2百萬個平均讀取所能檢測到的顯著差異表達基因數（sig DEGs）要多于微陣列芯片所能檢測到的sig DEGs數。在p ≤0.05和倍數變化f≥2標準下，在HBRR和UHRR樣本中Ion PGM™測序儀得到的sig DEGs數為4,630，而相比之下芯片得到的sig DEGs數為4,198將Ion PGM™測序儀生成的兩百萬個已定位讀取所產生的基因差異表達結果與qPCR結果相比較，發現qPCR 和RNA-Seq得到的sigDEGs倍數變化的對數值的Pearson相關系數（R）超過0.95。

             在Ion PGM™平臺進行RNA-Seq實驗的另一個優勢在于，能夠應用ERCC RNA Spike-In Mix對轉錄本檢測靈敏度進行評估。這些ERCC轉錄本混合物是一些含多聚腺苷酸化且無標記的RNA，該混合物經過美國國家標準技術研究所（NIST）鑒定，是評估RNA測量系統性能的工具，能控制實驗可變因素。這些ERCC轉錄本的GC含量經過平衡，更貼近真核生物內源性mRNA的特征，它們的長度范圍在250 到2,000個核苷酸之間。ERCC轉錄本混合物的含量構成經特殊設計，能代表一個大動態范圍的表達水平。ERCC ExFold RNA Spike-In Mix可用于評估基因差異表達的檢測靈敏度。這些質控RNA使用戶得以直接評估文庫質量、檢測靈敏度、動態范圍以及表達倍數變化。劑量響應散點圖顯示，ERCC相對濃度的對數值與已定位讀取數的對數值呈線性關系（圖2）。利用這些外部RNA質控有助于將來自合作實驗室所產生的結果進行直接比較。